科研小白入門(mén)必修之MTT實(shí)驗(yàn)操作總結(jié)

1.接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000－10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積180ul-200ul.

2.培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，正常培養(yǎng)2-3天也可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間。

3.顯色：每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul.繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。

4.比色：選擇480nm-570nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線或計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、細(xì)胞相對(duì)增殖率等。

1.細(xì)胞消化。若消化出現(xiàn)問(wèn)題，則會(huì)影響細(xì)胞的活性，進(jìn)而影響 OD 值。對(duì)于 MCF-7、BT474等一系列容易消化的細(xì)胞，消化時(shí)胰蛋白酶中不添加 EDTA，只需胰酶浸潤(rùn)數(shù)秒即可。然而，對(duì)于caco-2等一系列難以消化的細(xì)胞，胰蛋白酶中可添加濃度為 0.25% 的 EDTA。

2.選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。

3. 結(jié)晶物的溶解。加入 DMSO 溶解后，將加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱內(nèi)孵育 10～20 min，這樣有助于 DMSO對(duì)紫色結(jié)晶物的溶解（尤其在冬天）。

4..避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在顯色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液，棄去培養(yǎng)液時(shí)，吸取的時(shí)候要注意移液頭要緊貼孔內(nèi)側(cè)壁吸取，不要觸碰底部的紫色結(jié)晶；或者將96孔板倒扣于濾紙上來(lái)吸取孔內(nèi)的培養(yǎng)液。

5.設(shè)空白對(duì)照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。每組設(shè)定3復(fù)孔。

6.MTT粉末和溶液保存時(shí)都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。

7.酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀使用前應(yīng)打開(kāi)電源預(yù)熱半小時(shí)。

8.選擇不同的波長(zhǎng)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)靈敏度不同。應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)的波長(zhǎng)。