細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)-CCK-8 法

實(shí)驗(yàn)原理：

Cell Counting Kit-8（簡(jiǎn)稱CCK-8）試劑可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

一、用途：

            藥物篩選、

            細(xì)胞增殖測(cè)定、

            細(xì)胞毒性測(cè)定、

            腫瘤藥敏試驗(yàn)等。

二、優(yōu)點(diǎn)：

· 使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑；

· CCK-8法能快速檢測(cè)；

· CCK-8法的檢測(cè)靈敏度很高，甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度；

· CCK-8法的重復(fù)性優(yōu)于MTT 法，MTT 實(shí)驗(yàn)生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機(jī)溶劑溶解；

· 而本方法產(chǎn)生的formazan 是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來(lái)的誤差；

· CCK-8法對(duì)細(xì)胞毒性小，可以多次測(cè)定選取最佳測(cè)定時(shí)間，與MTT 方法相比線性范圍更寬，靈敏度更高；

· CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑中為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開(kāi)即用。

三、所需設(shè)備及儀器：

1. 10ul，100-200ul及多通道移液器

2. 酶標(biāo)儀（帶有450nm濾光片）

3. 96孔培養(yǎng)板

4. 二氧化碳培養(yǎng)箱

四、方法及步驟：

實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞增殖分析

1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)（約1-2×104），每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做4-6個(gè)重復(fù)。

3、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4小時(shí)，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來(lái)誤差，建議將槍頭浸入培養(yǎng)液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。或者直接配置含10%CCK8的培養(yǎng)基（現(xiàn)用現(xiàn)配），以換液的形式加入。

5、培養(yǎng)0.5-4小時(shí):細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件（建議預(yù)實(shí)驗(yàn)先摸清楚時(shí)間點(diǎn)）。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長(zhǎng)的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。

6、測(cè)定450nm吸光度：建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)450-490nm，參比波長(zhǎng)600-650nm。

實(shí)驗(yàn)二：細(xì)胞毒性分析

1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)

2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)（約≥5×104），每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做4-6個(gè)重復(fù)。

3、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4小時(shí)，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入不同濃度的毒性物質(zhì)。

5、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：加入毒性物質(zhì)的培養(yǎng)時(shí)間，要看毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性，一般要根據(jù)細(xì)胞周期來(lái)決定，起碼要一代以上的時(shí)間（例如：6、12、24、48、60、72小時(shí)）。

6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來(lái)誤差，建議將槍頭浸入培養(yǎng)液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。

7、培養(yǎng)0.5-4小時(shí):細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長(zhǎng)的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。

8、測(cè)定450nm吸光度：建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)450-490nm，參比波長(zhǎng)600-650nm。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

· 若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

· 如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

· 當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。

· 酚紅和血清對(duì)CCK8法的檢測(cè)不會(huì)造成干擾，可以通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

· CCK8可以檢測(cè)大腸桿菌，但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每次測(cè)定的過(guò)程中需要避免細(xì)菌污染，以免影響結(jié)果。

· CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個(gè)月，在-20℃下避光可以保存1年。

· 當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔加培養(yǎng)基或者PBS，不作為測(cè)定孔用。

· 在培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度即為空白對(duì)照。在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度作為空白對(duì)照。

· 金屬對(duì)CCK-8顯色有影響：當(dāng)終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10 mM的話，將會(huì)100%抑制。

· 懸浮細(xì)胞由于染色比較困難，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。

· 加入CCK-8 時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色或pH 值已變化，建議換用新鮮的培養(yǎng)基。

·  用酶標(biāo)儀檢測(cè)前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒(méi)有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定，且要擦拭干凈樣品板了。

六、經(jīng)驗(yàn)總結(jié)及分享：

CCK8的說(shuō)明書(shū)大家一定要認(rèn)真閱讀，里面很多細(xì)節(jié)的問(wèn)題都有提到。而且說(shuō)明書(shū)里提供的一些關(guān)于各種細(xì)胞的種板數(shù)都很有參考價(jià)值，因?yàn)槟鞘欠磸?fù)驗(yàn)證過(guò)的最佳數(shù)值。但無(wú)論如何，做這個(gè)試驗(yàn)一定要摸條件。你就算再懶，這個(gè)懶不得，否則你都只是在做無(wú)用功。以下言論全部以細(xì)胞毒性試驗(yàn)為前提， 如果你做的是促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物的藥效實(shí)驗(yàn)?zāi)蔷土懋?dāng)別論了。

摸條件包括1、種板數(shù)；2、種板后細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)時(shí)間；3、加藥后的孵育時(shí)間；4、cck8試劑加入量；5、cck8試劑加入后細(xì)胞孵育時(shí)間?？雌饋?lái)很多，其實(shí)這就是一個(gè)實(shí)驗(yàn)。而且都是種的空白板，也就是不加藥物，只加細(xì)胞和CCK8。

1、種板數(shù)：這個(gè)要查文獻(xiàn)，看你所用細(xì)胞別人有無(wú)做過(guò)，把范圍大致找出。記住還要參考說(shuō)明書(shū)，這個(gè)很重要。然后稀釋一系列濃度種板。首先你要觀察多長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞可貼壁*，一般貼壁生長(zhǎng)24小時(shí)。然后還有在你的實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，不同細(xì)胞數(shù)下孔內(nèi)生長(zhǎng)情況。比如我擬定考察4天的時(shí)間，那么在4天內(nèi)，細(xì)胞是剛好鋪滿還是堆積生長(zhǎng)？因?yàn)槊繅K板都會(huì)設(shè)置對(duì)照孔，也就是含有細(xì)胞的培養(yǎng)基+CCK8，這個(gè)數(shù)值是板上的最大數(shù)值，CCK8試驗(yàn)最佳OD值在1.0附近，所以這個(gè)最大數(shù)值最好能控制在1.0左右。我的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)是不要讓細(xì)胞長(zhǎng)滿，一旦長(zhǎng)滿了很難去判斷是否堆積生長(zhǎng)了，對(duì)藥物能否順利進(jìn)入細(xì)胞有影響此為其一，其二生長(zhǎng)不均勻易導(dǎo)致孔間OD值數(shù)據(jù)偏差大，而且OD值也很大。

2、貼壁生長(zhǎng)的時(shí)間我一般就直接讓它貼壁長(zhǎng)24h了，這個(gè)時(shí)間細(xì)胞已經(jīng)貼壁*，而且這樣設(shè)置時(shí)間對(duì)自己安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間也方便。沒(méi)人愿意大半夜爬起來(lái)做實(shí)驗(yàn)吧。

3、加藥后的孵育時(shí)間，我的實(shí)驗(yàn)摸了3個(gè)時(shí)間，24h，48h，72h。然后根據(jù)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來(lái)選擇最為好的時(shí)間。太長(zhǎng)了就沒(méi)有必要了，細(xì)胞呆在孔里幾天不換液結(jié)果可想而知了。

4、CCK8試劑加入量，說(shuō)明書(shū)中明確寫出建議加入量為培養(yǎng)基體積的10%。這里有一個(gè)問(wèn)題：假設(shè)我要孔內(nèi)是200微升的體系，即細(xì)胞懸液+藥液+CCK8=200微升呢，還是細(xì)胞懸液+藥液=200微升，cck8不算在體系內(nèi)呢。關(guān)于這一點(diǎn)文獻(xiàn)報(bào)道不一致。本人最終采用的是后者。

5、cck8試劑加入后孵育時(shí)間，隨著時(shí)間的增加，OD值就會(huì)增大。總之原則就是把OD值控制在1.0左右。這里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。

再說(shuō)一下關(guān)于種板設(shè)置問(wèn)題。眾人周知周圍一圈孔因?yàn)檫吘壭?yīng)都是不用來(lái)做實(shí)驗(yàn)的。一般每組樣品我會(huì)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，得到的OD值去掉最大值與最小值，其余取平均值。我用的是排槍，會(huì)省很多力氣，但是也會(huì)增大組內(nèi)誤差。這個(gè)只有通過(guò)校正移液槍和選用最適槍頭了。

做這個(gè)實(shí)驗(yàn)我想大家遇到的最大問(wèn)題應(yīng)該是數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，組內(nèi)數(shù)據(jù)偏差大。講了很多怎樣摸條件，其實(shí)就一個(gè)原則，把OD值控制在1.0左右。數(shù)據(jù)不穩(wěn)定也只能通過(guò)增大樣品數(shù)，借助數(shù)據(jù)處理來(lái)彌補(bǔ)。還有實(shí)驗(yàn)操作一定要仔細(xì)小心，盡量平行操作。

補(bǔ)充： 突然想起用酶標(biāo)儀檢測(cè)的時(shí)候還有一些細(xì)節(jié)問(wèn)題。比如孔里不能有氣泡，如果有氣泡，就用吸耳球吹掉，氣泡會(huì)很影響檢測(cè)結(jié)果。樣品板要擦拭干凈，當(dāng)然了，蓋子一定要記得拿掉啊Big Smile補(bǔ)充說(shuō)明：這幾天有同學(xué)提出了一個(gè)問(wèn)題，這個(gè)問(wèn)題非常好也非常關(guān)鍵：將OD值控制在1.0這個(gè)說(shuō)法是否有依據(jù)？

這里我還是想提醒大家一定要認(rèn)真閱讀試劑盒的說(shuō)明書(shū)，試想一個(gè)試劑盒的上市并且作為技術(shù)手段得到認(rèn)可需要經(jīng)過(guò)多少試驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證。我購(gòu)買的是同仁化學(xué)研究所的CCK8試劑盒，說(shuō)明書(shū)的P7Q23：OD值在什么范圍比較合適？答：一般情況下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比較好。

再說(shuō)到自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，酶標(biāo)儀的原理其實(shí)和紫外分光光度計(jì)是一樣的，所以UV上很多減小誤差的注意事項(xiàng)在酶標(biāo)儀上同樣受用。這就能夠理解為什么不能有氣泡，為什么要擦拭干凈樣品板了。再者熟悉UV原理的同學(xué)會(huì)了解利用紫外檢測(cè)有一個(gè)最佳檢測(cè)范圍，超過(guò)了這個(gè)范圍，數(shù)值就會(huì)呈現(xiàn)出不穩(wěn)定，無(wú)規(guī)律。（大家可以把自己的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析看看是不是數(shù)值控制在1.0附近更穩(wěn)定。）而更有甚者就是超出了儀器的檢測(cè)范圍，儀器讀數(shù)為—。我在摸條件的時(shí)候，cck8加入2.0h后檢測(cè)就出現(xiàn)過(guò)酶標(biāo)儀讀不出數(shù)據(jù)的情況。

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