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    細(xì)胞培養(yǎng)遇到問題？怎么解決？

    發(fā)布時間： 2022-01-15　　點擊次數(shù)： 1537次

    培養(yǎng)細(xì)胞的過程中，時常會遇到各種的問題，怎么辦？以下是整理的一些常用問題的解決辦法。



    培養(yǎng)液pH值變化太快

    可能原因：

    (1)CO2張力不對。
    (2)培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊。
    (3)NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足。
    (4)培養(yǎng)液中鹽濃度不正確。
    (5)細(xì)菌、酵母或真菌污染。

    建議解決方法：

    (1)按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對應(yīng)CO2濃度為5%到10%。
    (2)松開瓶蓋1/4圈。
    (3)改用不依賴CO2培養(yǎng)液。加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度。
    (4)在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks鹽配制的培養(yǎng)液。
    (5)丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。

    培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變

    可能原因：

    (1)洗滌劑清洗后殘留有磷酸鹽，將培養(yǎng)基成分沉淀下來。
    (2)冰凍保存培養(yǎng)液。

    建議解決方法：

    (1)用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后滅菌。
    (2)將培養(yǎng)液加熱到37℃，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。

    培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，同時pH發(fā)生變化

    可能原因：

    (1)細(xì)菌或真菌污染。

    建議解決方法：

    (1)丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。

    培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁


    可能原因：

    (1)胰蛋白酶消化過度。
    (2)支原體污染。
    (3)培養(yǎng)瓶瓶底不干凈。

    (4)培養(yǎng)液pH值過堿(NaHCO3分解)。

    (5)消化液或培養(yǎng)液配制錯誤、過期儲存、儲存不當(dāng)。
    (6)細(xì)胞老化(如傳代前細(xì)胞已匯合導(dǎo)致失去貼附性)。
    (7)接種細(xì)胞起始濃度太低或太高。

    建議解決方法：

    (1)縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度。
    (2)分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
    (3)注意刷洗，或換用一次性塑料培養(yǎng)瓶。
    (4)使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2(將培養(yǎng)液敞口放入培養(yǎng)箱也可)。
    (5)重新配置消化液或培養(yǎng)液。
    (6)啟用新的保種細(xì)胞。
    (7)調(diào)節(jié)最佳接種細(xì)胞濃度。

    懸浮細(xì)胞成簇

    可能原因：

    (1)培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子。
    (2)支原體污染。
    (3)蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解釋。
    (4)DNA污染。

    建議解決方法：

    (1)用無鈣鎂平衡鹽氵容液洗滌細(xì)胞，輕輕吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液。
    (2)分離培養(yǎng)物，檢測支原體。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
    (3)用DNase I處理細(xì)胞。 

    原代細(xì)胞培養(yǎng)物污染

    可能原因：

    (1)原代培養(yǎng)組織在進(jìn)入培養(yǎng)前已污染。

    建議解決方案：

    (1)培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織。

    培養(yǎng)細(xì)胞生長減慢

    可能原因：

    (1)由于更換不同培養(yǎng)液或血清。

    (2)培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞。
    (3)培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染。
    (4)試劑保存不當(dāng)。
    (5)接種細(xì)胞起始濃度太低。
    (6)細(xì)胞已老化。
    (7)支原體污染。

    建議解決方案：

    (1)比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實驗。讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。
    (2)換入新鮮配制培養(yǎng)液，或補加谷氨酰胺及生長因子。
    (3)用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物?；蛴每股爻?br style="margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box; overflow-wrap: break-word !important;"/>(4)血清需保存在-5℃到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清*培養(yǎng)液在2-8℃保存，并在2周內(nèi)用完。
    (5)增加接種細(xì)胞起始濃度，換用新的保種細(xì)胞。
    (7)分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

    培養(yǎng)細(xì)胞死亡

    可能原因：

    (1)培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2。
    (2)培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大。
    (3)細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷。
    (4)培養(yǎng)液滲透壓不正確。
    (5)培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積。
    (6)更多原因參考問題4和問題7。

    建議解決方案：

    (1)檢測培養(yǎng)箱內(nèi)CO2。
    (2)檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度。
    (3)取新的保存細(xì)胞種。
    (4)檢測培養(yǎng)液滲透壓。注意：大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞能耐受滲透壓為260– 350 mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。
    (5)換入新鮮培養(yǎng)液。


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