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    牙簽法小量制備質粒DNA實驗

    發(fā)布時間： 2021-12-24　　點擊次數(shù)： 1470次

    原理

    用牙簽從瓊脂培養(yǎng)基上挑取的菌落可直接用于制備質粒 DNA。所得的閉合環(huán)狀 DNA 往往雜質太多，不能作為大多數(shù)限制酶的底物。

    材料與儀器

    抗生素 溴酚藍溶液 EDTA 溴化乙錠 NSS 溶液 KCl 瓊脂糖凝膠
    LB、YT 或 SOB 熱循環(huán)儀 木質牙簽

    步驟

    一、材料

    1. 緩沖液和溶液

    (1) 用于篩選質粒的抗生素

    (2) 溴酚藍溶液（0.4%，m/V）或甲酚紅溶液（10 mmol/L）

    (3) EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0 )

    (4) 溴化乙錠（10 mg/ml ) 或 SYBR Gold

    (5) KCl ( 4 mol/L)

    (6) NSS 溶液：0.2 mol/L NaOH，0.5% SDS，20% 蔗糖。

    2. 凝膠

    (1) 瓊脂糖凝膠（0.7%，5 mm 厚），用不含溴化乙錠的 Tris-乙酸鹽或 Tris-乙酸鹽緩沖液配制及電泳。

    當質粒大小只有很小的差別時，瓊脂糖凝膠電泳應使用 Tris-硼酸鹽電泳緩沖液（TAE），因為它溶解不同大小超螺旋 DNA 的能力更強。否則應使用 Tris-硼酸鹽-EDTA ( TBE）緩沖液，因為它有更強的緩沖能力。

    (2) 瓊脂糖凝膠

    3. 培養(yǎng)基

    (1) LB、YT 或 SOB ( 用于培養(yǎng) E.coli 的高營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基）

    (2) LB、YT 或含適當抗生素的 SOB 瓊脂平板

    4. 專用設備

    (1) 熱循環(huán)儀

    (2) 調至 70℃ 的水浴

    (3) 木質牙簽

    二、方法

    1. 細胞的制備

    (1) 在含適當抗生素的富養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 ( LB、YT 或 SOB ) 上培養(yǎng)轉化了適當質粒的菌落， 直到它們的直徑長至 2~3 mm ( 對于大多數(shù)菌株，需在 37℃ 下培養(yǎng)約 18 ~24 h )。

    (2) 用無菌牙簽或一次性小環(huán)將細菌菌落的一小塊轉移到含適當抗生素的一條或一小塊瓊脂母板上，將該菌落的剩余部分轉移到已編號的微量離心管中，管內含有 50 μl 無菌的 10 mmol/L EDTA ( pH 8.0 )。

    除待實菌落外，還應轉移幾個“空" 菌落（不含外源基因的質粒載體）。這幾個樣品可在凝膠電泳中用做分子質量標準參照物。

    (3) 重復步驟 2，直到收獲預期數(shù)目的菌落。

    (4) 當所有菌落都被復制和轉移之后，將母板在 37℃ 培養(yǎng)幾個小時后于 4℃ 保存，直到得到凝膠電泳結果。然后從母板上收獲其質粒為預期大小的菌落。

    (5) 在培養(yǎng)母板的時候，對細菌懸液進行以下的處理；在每一微量離心管中順序加入 20 μl 新配置的 NSS 溶液。蓋上管蓋，振蕩混勻 30 s。

    (6) 將所有離心管轉移到 70℃ 熱水浴中放置 5 min，然后于室溫冷卻。

    (7) 在各管中加入 1.5 μl 的 4 mol/L KCl 溶液，振蕩混勻 30 s。

    (8) 將離心管在冰上放置 5 min。

    (9) 在 4℃ 下以最大速度離心 3 min 以除去細菌碎片。

    2. 質粒的凝膠電泳分析

    (1) 將上清依次轉移到潔凈離心管中。如果只用瓊脂糖凝膠電泳分析樣品，在每管中加入 0.4% 的溴酚藍溶液；如果既要用瓊脂糖電泳又要用 PCR 分析，則在樣品中加入 2 μl 10 mmol/L 甲粉紅。在 0.7% 的瓊脂糖凝膠（5 mm 厚）的加樣孔（5 mm 長，2.5 mm 寬）中加 50 μl 上清。

    瓊脂糖凝膠不含溴化乙錠，且所用的緩沖液也不含溴化乙錠，因為這樣超螺旋 DNA 的遷移率比插入染料后更準確地反映其分子質量。這就能更容易地區(qū)分不同大小的質粒。

    (2) 當溴酚藍遷移到膠的 2/3 或 3/4 處，或甲酚紅遷移到膠的一半時，室溫下將膠浸在溴化乙錠溶液（0.5 μg/ml 的水溶液）中染色 30~45 min。在紫外燈下觀察凝膠并拍照。

    (3) 如果在 (1) 中使用甲酚紅，則宜用 PCR 方法分析上清 ( 用各樣品的剩余液作為模板 )。

    甲酚紅（Merk Index 公司）在酸性溶液中是橙色到琥珀色的，pH 為 7.2 時是黃色的，在堿性溶液中是紅色的。與溴酚藍和二甲苯藍不同，甲酚紅不抑制 DNA 聚合酶（Taq 聚合酶，從嗜熱古細菌中提取）的熱穩(wěn)定性（Hoppe et al. 1992 )。因而，含甲酚紅的 DNA 溶液在大多數(shù)擴增反應中可用。此染料在 2% 的瓊脂糖凝膠中的遷移位于在二甲苯藍和溴酚藍之間，大小大約相當于 300 bp ( Hoppe et al. 1992 )。在瓊脂糖凝膠電泳照片上，甲酚紅不會產生像溴化乙錠染色一樣的陰影。

    (4) 將母板上可能含有重組子的菌落接種到含適當抗生素的 2 ml 液體培養(yǎng)基（LB、YT 或 SOB ) 中，進行小規(guī)模培養(yǎng)。

    不需要等到母板上的菌落長到很大。細菌即使只是薄薄的一層，也足夠接種用。

    (5) 用此小規(guī)模培養(yǎng)物小量制備待測的重組子質粒。用酶切及瓊脂糖電泳分析質粒 DNA，以確證其大小和結構與預期一致。

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