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    【外泌體應用】天然納米藥物載體

    發(fā)布時間： 2021-10-08　　點擊次數(shù)： 3659次

    外泌體是來源于細胞內膜的30-180 nm的脂質雙層包裹的囊泡，包含有核酸、蛋白質和脂質等生命物質，在細胞外環(huán)境中循環(huán)，是細胞間通訊工具。外泌體在形成的過程中，會把一些蛋白質、活性酶囊括在內以及攜帶一系列的寡核苷酸，特別是線粒體DNA，mRNA，miRNA和許多其它非編碼RNA等。因而外泌體是天然的多功能載體，可以包裹并遞送各種生命物質，例如小RNA、mRNA和蛋白質等。相對于脂質體和病毒載體，外泌體穩(wěn)定性高，生物相容性好，免疫原性低，而且可以滲透生物屏障（例如血腦屏障、胎盤屏障），故外泌體作為天然納米型藥物遞送載體有著巨大應用前景。

    外泌體作為藥物載體的優(yōu)勢


    生物來源的外泌體作為載體，具備良好的生物相容性，生物可降解性，低毒性，穩(wěn)定性以及低免疫原性。


    首先，外泌體是納米級囊泡，具有穩(wěn)定的磷脂雙分子層結構，可以裝載大量的水溶性物質。其次，外泌體表面有很多跨膜蛋白，在結構上還具有可改造性，通過基因修飾，實現(xiàn)體內靶向治療。此外，外泌體自身具有細胞選擇性與組織特異趨向性，可以通過血腦屏障和穿透致密結構組織。而且在治療上，外泌體載體還有易于注射和防止血管堵塞的特點?？偠灾?，天然的外泌體在藥物遞送和疾病治療有著巨大的潛力。


    外泌體加載藥物的方式


    1、外泌體直接加載藥物


    電穿孔法是將藥物加載到外泌體中比較成熟的方法。電穿孔法的原理是將外泌體和藥物懸浮液暴露在電場中，外泌體膜上短暫的高壓脈沖下會產生無數(shù)的孔，藥物小分子則滲透到外泌體中。電穿孔方法簡單且省時，但高壓脈沖會使外泌體聚集，降低藥物加載效率。


    除了電穿孔法外，還有其他方法將藥物加載到外泌體，如藥物和外泌體直接混合，超聲處理，轉染試劑等。超聲處理是一種應用超聲波將藥物加載入外泌體的方法，具有高載藥效率和持續(xù)藥物釋放的優(yōu)點。



    2、外泌體分泌前加載藥物


    藥物與細胞一起孵育的方式，可以將藥物通過分泌外泌體釋放到培養(yǎng)基。即先將藥物載入到源細胞中，通過分離純化獲得載藥外泌體。另外還有比較常用的一種方法是轉染，即將小分子RNA轉染至源細胞。


    間充質干細胞（MSCs）因其在腫瘤微環(huán)境中的定位能力而被應用于輸送抗癌藥物。Pascucci等發(fā)現(xiàn)經紫杉醇（PTX）誘導后，骨髓MSCs分泌的外泌體載有紫杉醇，通過超速離心將外泌體分離出來，研究其對人胰腺癌細胞株的影響，結果表明負載紫杉醇的MSCs分泌的外泌體含大量紫杉醇，具有較強的抗腫瘤活性。


    外泌體遞送的藥物類型

    外泌體最大的特性之一是它們穿過屏障（如細胞質膜和血腦屏障）的能力，作為藥物遞送載體具有很大潛力，適用于遞送各種化學物質、蛋白質、核酸和基因治療劑。


    1、外泌體作為小分子藥物遞送載體


    腫瘤治療需要低免疫原性和低毒性的靶向藥物載體。2013年Tian等發(fā)表在Biomaterials的文章通過電穿孔將化療藥物如阿霉素（Dox）加載到iRGD肽功能化的外泌體，輸送到BALB/c裸鼠的腫瘤組織中。為了降低免疫原性和毒性，使用小鼠未成熟樹突狀細胞（IMDC）產生外泌體。通過工程化IMDC以表達與αv整合素特異性iRGD肽融合的外泌體膜蛋白（Lamp2b），具有腫瘤靶向性。從IMDC純化的外泌體通過電穿孔加載Dox，加載率高達20%。靜脈注射靶向性外泌體將Dox特異性地輸送到腫瘤組織，抑制腫瘤生長而無明顯毒性。

    【外泌體應用】天然納米藥物載體

    熒光共聚焦成像，iRGD-Exos在細胞內遞送Dox藥物



    2、外泌體作為CRISPR-Cas9質粒的載體


    CRISPR/Cas9是一種很有前途的基因編輯技術。迄今為止，CRISPR/Cas9的細胞內運載體受到免疫原性、運載容量和低耐受性等問題的限制。McAndrews等在今年的Life Sci Alliance期刊發(fā)表文章，報告了一種基于工程外泌體的CRISPR/Cas9非病毒遞送系統(tǒng)。


    文章表明，非自體外泌體可以通過常用的轉染試劑包封CRISPR/Cas9質粒DNA，并且可以運送到受體癌細胞以誘導靶向基因缺失。在胰腺癌的原位模型中，裝載CRISPR/Cas9的外泌體可以靶向胰腺癌細胞中的突變Kras G12D致癌等位基因，從而抑制癌細胞增殖和生長。外泌體是CRISPR/Cas9基因編輯靶向治療的一個潛在遞送系統(tǒng)。


    3、外泌體作為核酸藥物遞送載體


    外泌體包含miRNA、siRNA、mRNA等，說明外泌體具有對核酸藥物的天然包容性。外泌體可以攜帶遺傳基因（例如miRNA，siRNA）到靶細胞中，從而在生物學和致病過程中誘導遺傳修飾。外泌體的這種特征受到了基因治療的青睞。


    2011年Alvarez-Erviti等發(fā)表在Nat Biotechnol上文章，研究外泌體將siRNA遞送到小鼠大腦。為了降低免疫原性，作者使用自體樹突狀細胞分泌的外泌體，通過樹突狀細胞表達外泌體膜蛋白Lamp2b，融合到神經元特異性RVG肽，實現(xiàn)了靶向。利用電穿孔法將純化的外泌體加載外源性siRNA。靜脈注射靶向外泌體將siRNA特異性傳遞給大腦中的神經元、小膠質細胞。


    結果表明，在治療阿爾茨海默病的小鼠模型中，外泌體可以作為siRNA向大腦遞送的有效載體。


    【外泌體應用】天然納米藥物載體

    靶向外泌體基因遞送的給藥示意圖


    Naseri等利用從骨髓間充質干細胞中分離的外泌體（MSCs-Exo）來遞送LNA（locked nucleic acid）修飾的抗miR-142-3p寡核苷酸，以抑制4T1和TUBO乳腺癌細胞系中miR-142-3p和miR-150的表達水平。體外實驗結果表明，MSCs-Exo能有效地遞送抗miR-142-3p，降低miR-142-3p和miR-150水平。作者還評估了MSCs-Exo在荷瘤小鼠體內的分布。體內實驗結果表明，MSCs-Exo可以穿透腫瘤部位，將抑制性寡核苷酸導入腫瘤組織，從而下調miR-142-3p和miR-150的表達水平。MSCs來源外泌體可以作為可行的納米載體遞送RNA藥物分子。


    【外泌體應用】天然納米藥物載體

    MSCs-Exo在荷瘤小鼠體內的分布


    4、外泌體作為蛋白質的藥物遞送載體


    蛋白質藥物相對于基因藥物更直接，但是直接進入生物體內的蛋白質藥物容易引起免疫反應而被清除。已經發(fā)現(xiàn)外泌體可遞送多種蛋白質，如酶、細胞骨架蛋白質和跨膜蛋白質等。


    Yim等2016年發(fā)表文章使用光誘導外泌體加載治療蛋白，使用藍光控制可逆的蛋白-蛋白相互作用模型和內源性外泌體發(fā)生過程，將蛋白質裝載到外泌體中。該研究小組將蛋白治療劑與感光色素蛋白2（CRY2）相結合，外泌體與螺旋-環(huán)-螺旋（CIBN）相結合，然后用450~490 nm波長的藍光照射，此時蛋白質治療劑和外泌體將會結合在一起。結果表明，該技術可誘導蛋白質治療劑到達靶細胞，是一種高效的外源蛋白質裝載方法，可以作為一種有效的將蛋白治療藥物載入到受體細胞和組織的方法。


    【外泌體應用】天然納米藥物載體

    藍光控制可逆的蛋白-蛋白相互作用模型和內源性外泌體發(fā)生過程示意圖



    Nature Biotechnology雜志去年發(fā)表文章，報道了多家大型制藥公司如禮來、武田、拜耳等押注外泌體和其他細胞外囊泡，作為治療藥物遞送的一種手段。Aruna Bio公司于2019年7月完成1300萬美元的融資，用于支持神經外泌體遞送平臺的持續(xù)開發(fā)和新型神經外泌體療法的推進?？偛课挥谟＝虻?Evox Therapeutics 于2017年12月宣布與勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）進行合作，研究外泌體介導與RNAs藥物遞送，并于2018年9月獲得3550萬英鎊的B輪融資。


    盡管外泌體作為藥物載體是一個熱門研究方向，但現(xiàn)階段還有技術問題有待解決。其一是大規(guī)模高效生產（【外泌體研究】FiberCell為您富集高濃度的外泌體），還有就是外泌體的純化純化技術，對于大規(guī)模外泌體的純化目前還沒有很好的解決方案，這是目前外泌體應用上所面臨的重大挑戰(zhàn)。


    參考文獻：


    • Pascucci L, Coccè V, Bonomi A, et al. Paclitaxel is incorporated by mesenchymal stromal cells and released in exosomes that inhibit in vitro tumor growth: a new approach for drug delivery. J Control Release. 2014;192:262-270. 

    • Tian Y, Li S, Song J, et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 2014;35(7):2383-2390. 

    • McAndrews KM, Xiao F, Chronopoulos A, et al. Exosome-mediated delivery of CRISPR/Cas9 for targeting of oncogenic KrasG12D in pancreatic cancer. Life Sci Alliance. 2021;4(9):e202000875.

    • Alvarez-Erviti L, Seow Y, Yin H,et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 2011;29(4):341-345. 

    • Naseri Z, Oskuee RK, Jaafari MR, Forouzandeh Moghadam M. Exosome-mediated delivery of functionally active miRNA-142-3p inhibitor reduces tumorigenicity of breast cancer in vitro and in vivo. Int J Nanomedicine. 2018;13:7727-7747. 

    • Yim N, Ryu SW, Choi K, et al. Exosome engineering for efficient intracellular delivery of soluble proteins using optically reversible protein-protein interaction module. Nat Commun. 2016;7:12277. 


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