ELISA實驗操作中值得關(guān)注的細(xì)節(jié)大盤點

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）因其具有敏感性高、特異性強等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于臨床檢測中的各種抗原和抗體的測定。盡管 ELISA 操作簡單，但是小實驗里也蘊含著大文章，ELISA 操作各個環(huán)節(jié)對實驗的檢測效果影響較大，稍不注意就會產(chǎn)生假陽性或假陰性的結(jié)果?，F(xiàn)在就跟大家 818 應(yīng)用 ELISA 應(yīng)該了解的一些常識。

ELISA 分類及具體過程 

一般，ELISA 可分為以下四大類：直接 ELISA、間接 ELISA、夾心 ELISA、競爭抑制 ELISA。其他的 ELISA 都隸屬于這四類 ELISA 或由這四類 ELISA 組合衍生。下面分析 ELISA 實驗操作中可能影響結(jié)果的原因，并給出相應(yīng)的解決方法。

樣品收集和保存 

用于 ELISA 測定較為常用的臨床標(biāo)本是血清（漿）。要注意避免嚴(yán)重溶血，因為血紅蛋白中含有具有類似過氧化物活性的血紅素基團(tuán)，在孵育時很容易吸附于固相，與 HRP 底物反應(yīng)產(chǎn)生假陽性。 

樣品采集及血清分離中要注意避免細(xì)菌污染，一方面細(xì)菌分泌的酶可能對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用，另一方面，細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的 β-半乳糖苷酶會對相應(yīng)酶作標(biāo)記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。 

樣品應(yīng)該要避免反復(fù)凍融。因反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機械剪切力對標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。另外，樣品混勻時，不要劇烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可。 

一般而言，如果在收集樣品的當(dāng)天進(jìn)行檢測，可將樣品及時儲存在 4℃?zhèn)溆茫欢鴮Ω籼煸贆z測的樣本，應(yīng)及時分裝后凍存在-20℃?zhèn)溆?，若要長期保存樣品，最好將其置于-70℃凍存。

試劑準(zhǔn)備 

在實驗開始前，需將試劑盒從冰箱中拿出來在室溫放置 20min，再進(jìn)行測定，以使試劑盒在 使用前與室溫平衡，也可使溫育時反應(yīng)孔內(nèi)的溫度能較快的達(dá)到所要求的高度，以滿足測定 要求。 

其次，目前商品中 ELISA 試劑盒中的洗板液均需在實驗過程中對其所提供的濃縮液進(jìn)行稀釋 配制，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)該保證質(zhì)量。此外，底物反應(yīng)液應(yīng)該反應(yīng)顯色 前進(jìn)行現(xiàn)配現(xiàn)用。同時，為了保證實驗的均一性，實驗中所有試劑在加樣前必須搖勻。

加樣 

因 ELISA 的靈敏度較高，則應(yīng)該按規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，以降低非特異性反應(yīng)，使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來。 

加樣品時，單孔用量要求：≥20ul/指標(biāo)，如需要做 2 個復(fù)孔則血量≥60ul/指標(biāo)。如果用量充足，最好提供 50ul/孔/指標(biāo)。具體用量也需根據(jù)試劑盒的要求而定。 

吸取樣品時，加樣槍頭不應(yīng)粘附多余的液體；加樣時不可 90 度向孔中滴加液體，否則會導(dǎo)致液體殘留在吸頭上，加樣不準(zhǔn)確。正確加樣方法應(yīng)為 45 度，吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入。

加樣時速度不可過快，否則無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性；要避免樣品加在孔壁上部而產(chǎn)生非特異性吸附。不可將樣品濺出以避免對鄰近孔產(chǎn)生污染。

孵育 

一般，孵育時間與溫度成反比，即溫度越高，所需時間相對較短。較為常用的孵育溫度為 37℃，孵育 1-2h。 

孵育時應(yīng)貼封片或加蓋，避免樣品或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗。孵育時，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。同時，應(yīng)嚴(yán)格控制孵育時間，避免因時間過長導(dǎo)致緊附于反應(yīng)孔周圍的非特異性結(jié)合。 

孵育時，要盡量排除“邊緣效應(yīng)"，即 96 孔板的外周孔顯色較中心孔深。究其原因，是因為 96 孔板周孔與中心孔的表面或熱力學(xué)特征不同。因此，可采用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至孵育溫度（37℃）。

洗板 

為了確保 ELISA 測定的特異性，洗板可清除非特異性結(jié)合物質(zhì)，減少背景信號，增加分析的信噪比。 

手工洗板時，拍板要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離。使用半自動洗板時，應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時可用注射器針頭挑出。為了達(dá)到較好的洗滌效果，實驗室可采用機器與人工洗滌相結(jié)合的方法，即在機器洗滌后再進(jìn)行人工洗板 1-2 次。

以 HRP 作為標(biāo)記酶的 ELISA 試劑盒中使用的洗板液一般為含 0.05% Tween20 的中性 PBS，其中，吐溫 20 的濃度可在 0.05%-0.2%之間，高于 0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低實驗的靈敏度。

顯色 

目前以 HRP 作為標(biāo)記酶的商品 ELISA 試劑盒中，如以 TMB 為底物，則提供的底物為 A 和 B 兩瓶應(yīng)用液；如以 OPD 為底物，則試劑盒提供 OPD 片劑或粉劑，臨用前配制。顯色劑配制后放置時間過長（肉眼可見淺藍(lán)色的 TMB 時）要棄之不用。 

在加入底物開始顯色反應(yīng)前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將 A 和 B 兩種液各加一滴于清潔的空板孔或 eppendorf 管中，觀察是否有顯色出現(xiàn)，如有，則說明底物已變質(zhì)。 

顯色反應(yīng)條件一般為 37℃或室溫反應(yīng) 15-30 分鐘。加終止液時，要避免氣泡產(chǎn)生而引起的假陽性。

讀板 

讀板時要保證酶標(biāo)板清潔，同時也要注意酶標(biāo)儀的波長是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。 

通常，單波長讀板的測定值一般是指以對顯色具有最大吸收的波長如 450nm 或 492nm 進(jìn)行比色測定；而雙波長讀板的測定值一般是敏感波長如 450nm 的吸光值與非敏感波長下如 630nm 的吸光值之差，可排除板內(nèi)臟物的影響。 

同時，由于 ELISA 測定中單個空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在 ELISA 測定比色時，最好是使用雙波長比色。

數(shù)據(jù)結(jié)果分析 

ELISA 的測定結(jié)果可分為兩種：定性測定和定量測定。前者只需確定陰性或陽性即可；后者則需要給具體的數(shù)值。在定量測定中，經(jīng)常要將標(biāo)準(zhǔn)品所獲得的吸光值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。 

下面則簡單介紹用 excel 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法 

1）輸入相應(yīng)數(shù)據(jù)

2）選中相應(yīng)數(shù)據(jù)

3）選擇表格中，菜單欄中的插入|散點圖中第一個類型

4）選中“圖表工具"中的“快速布局"中 fx 圖標(biāo)，即可得到以下圖表。Excel 版本較低的可以直接跳到第 6）步。

5）點中坐標(biāo)軸標(biāo)題，可做修改。修改后可獲得以下標(biāo)準(zhǔn)曲線。

6）或者在較低版本的 excel 中，在“圖表工具"選項中，選擇趨勢線|線性趨勢線。

7）選中圖表中的趨勢線，右鍵，選擇“設(shè)置趨勢線格式"，在彈出的對話框中，將“顯示公式" 勾選上，點擊關(guān)閉，也獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

8）可將試驗管中所測的吸光度值代入圖表中的公式 Y=1.001x+0.0171 后可得到所求成分的含量，即 X 的值。

ELISA 的疑難雜癥 

1）顯色淺，靈敏度低

2）假陽性多，本底高甚至花板

3）重復(fù)性不好

4）白板