DNA載體構(gòu)建——【干貨】三圖讓你秒懂質(zhì)粒圖譜

很多人拿到一個質(zhì)粒圖譜，第一反應只能是仰天長嘯，這是什么玩意？這些 ori、RBS、tet 是什么鬼？這些箭頭代表什么，轉(zhuǎn)錄的方向嗎？為什么都不相同，不會“撞車"么？ 來，看幾張圖，上面的問題就能一一破解。

第一步：先了解質(zhì)粒的基本組成元素。

1）復制起始點 Ori。該位點決定了質(zhì)粒的宿主及質(zhì)粒的拷貝數(shù)，它是質(zhì)粒中一段特定序列，富含 AT 和重復序列。

Tips：圖譜上只有一個 Ori，表示質(zhì)粒是原核克隆表達質(zhì)粒；有兩個 Ori，則表示該質(zhì)粒是，穿梭質(zhì)粒，即可在原核也可在真核中復制。

2）抗性篩選基因。圖譜中 Kan/tet 就是抗生素抗性基因，方便后續(xù)通過抗生素篩選陽性克隆。特點就是單詞最后會以大寫 R 或上標 r 結(jié)束。

Tips：一般克隆載體只有一種抗性篩選標記，部分表達載體及穿梭質(zhì)粒具有兩種抗性篩選標記。

3）多克隆位點（MCS），即一系列限制性內(nèi)切酶酶切位點，是外源 DNA 插入位點，一般可通過酶切/連接方式將外源 DNA 插入質(zhì)粒，外源 DNA 一般小于 10kb，而片段越長，轉(zhuǎn)化效率越低。

Tips: 一般位于轉(zhuǎn)錄啟動和轉(zhuǎn)錄終止信號之間；所包含的限制性內(nèi)切酶位點數(shù)量和組成因載體不同會有所差異，且其中的酶切位點在質(zhì)粒中為單一的酶切位點；同時在使用時需注意質(zhì)粒載體與外源 DNA 酶切位點的兼容性問題熒光標記或蛋白標簽序列。蛋白純化標簽蛋白：His-Tag，GST-Tag 等；蛋白檢測標簽蛋白：Myc-Tag，F(xiàn)lag-Tag，HA-Tag 等；熒光蛋白表達標簽：GFP，mCherry 等。

第二步：看質(zhì)粒是否是表達載體，如果是，那就必定有這些原件：啟動子－核糖體結(jié)合位 點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號。

1、啟動子：促進 DNA 轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列，可與 RNApol 特異性結(jié)合。

2、增強子/沉默子：前者是真核基因組中一種增強鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序，其作用與增強子所在位置或方向無關。后者是負增強子，負調(diào)控序列。

3、核糖體結(jié)合位點/起始密碼/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖體的兩個結(jié)合位點，對于原核而言是 AUG（起始密碼）和 SD 序列。

4、轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA  的保守序列，此位點 down-stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū)，這 2 部分共同構(gòu)成 poly（A）加 尾信號。

第三步：弄清楚方向，即為何質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時針而有的箭頭逆時針。

其實那是代表兩條 DNA 鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈 DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的某些基因在另一條鏈上。當然，最重要的是要弄清楚目的基因插入那一段（從 T7 啟動子到終止子那一段）的方向，即下圖黃色圈圈所示的箭頭方向，其它的大可以忽略。